Perfil da metilação de H3K4 e ativação da BRG1 em oócitos bovinos imaturos

Resumo

O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de H3K4 e BRG1 em oócitos imaturos. Foram coletados  ovários  de  abatedouro  local.  Folículos  antrais  foram  aspirados,  e  os  Complexos Cumulus Oophorus obtidos foram classificados  em grau 1 e 2. Em seguida foram desnudadose  fixados  em  PAF  3%  (Paraformoldeído)  e  armazendos  a  4  °C  para  posterior  análise  de imunocitoquímica. Os oócitos foram divididos em  dois grupos, H3K4 (15 oócitos) e BRG1 (15 oócitos).    Inicialmente os oócitos foram lavados  e  permeabilizados por  20 minutos à 0°C. Após três lavagens e bloqueio por 2 horas em temperatura ambiente, procedeu-se a incubação com  o  anticorpo  primário  policlonal,  anti-H3K4  tri-metil(Abcam,  ab8580;  1:500)  ou  antiBRG1 (Abcam, ab1932;  1:100)  over night  à 4°C. No  dia seguinte,  foram realizadas  quatro lavagens  e  em  seguida  foi  feita  a  incubação  com  anticorpo  secundário  anti-igG  de  coelho produzida em caprino (Alexafluor 594; 1:100)  por 5 horas em temperatura ambiente. Depois disso procederam-se  quatro vezes  lavagens de  10 minutos cada. A coloração do DNA nuclear foi  feita  com  Diamidino-2-fenilindol  (DAP;  1:10000)  por  20  minutos  no  escuro  emtemperatura ambiente. Após isso os oócitos foram fixados em  PAF 2% over night à 4°C. No terceiro  dia,  foram  preparadas  as  lâminas  para  as  análises  sob  microscópio  epifluorescente.Apenas 20% (3/15) dos oócitos avaliados foram marcados com  H3K4 e também  0,0% (0/15) foram  marcados  com  BRG1.  Os  resultados  preliminares  sugerem  que  oócitos  bovinos imaturos  apresentam a cromatina em estado  pouco ativo  mediado pela H3K4  desmetilada  e a inatividade de BRG1.